Unidad de Diluciones


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1 Universidad de Puerto Rico en Humacao Departamento de Biología Programa de Microbiología Aplicada Unidad de Diluciones Dr. Héctor L. Ayala del Río La detección y enumeración de microorganismos es un componente esencial de la microbiología. Sin embargo, la mayoría de los métodos de enumeración requieren que la carga microbiana de la muestra se encuentre dentro del rango de confiabilidad del método. Generalmente, las muestras analizadas tienen una carga microbiana mayor que la permitida por el método. Es necesario diluir la muestra de manera que la carga microbiana esté en el rango de confiabilidad del método. Entender los conceptos de diluciones nos permitirá diluir de manera apropiada las muestras y poder calcular la densidad de microorganismos en el cultivo original. Qué es una dilución? Una dilución se define como el acto de añadir un solvente a un soluto para reducir la concentración del soluto. Qué es el soluto? El soluto puede ser un compuesto químico como la glucosa o un microorganismo como Escherichia coli. El principio en ambos casos es el mismo, reducir la concentración (i.e. el número de moléculas de glucosa o Escherichia coli por unidad de volumen). Esto lo logramos añadiendo más solvente. El siguiente ejemplo ilustra el principio de diluciones: Tenemos un tubo con 0 células en 2 ml de solvente. Le añadimos 3 ml de solvente adicionales. Cómo cambió la concentración de células en el tubo luego de añadirle el solvente adicional? Para poder contestar la pregunta es necesario que calculemos la concentración de células antes y después de añadir los 3 ml de solvente. La concentración de células antes de añadir el solvente sería: número de células volumen 0 células = = 5 células 2 ml ml La concentración de células después de añadir 3 ml de solvente sería: número de células volumen = 0 células 0 células = = 2 células 2 ml + 3 ml 5 ml ml

2 Si observamos detenidamente el ejemplo, notaremos que la cantidad de células no cambia a pesar de añadir más solvente, lo que cambia es la cantidad de solvente en que se encuentran dichas células. Por consiguiente, el añadir más solvente disminuye la cantidad de células por unidad de volumen. Existen varias estrategias para diluir. En nuestros cursos de química aprendimos cómo diluir soluciones de las cuales conocemos la concentración original utilizando la siguiente fórmula: Ci "Vi = Cf "Vf donde C = concentración, V = volumen, i = inicial, y f = final. Si despejamos esta ecuación para que las concentraciones queden en un lado y los volúmenes en el otro tendremos: Ci Cf = Vf Vi Esta igualdad nos indica que existirá una proporcionalidad entre las concentraciones de las soluciones y los volúmenes de mezcla. Esta proporcionalidad es lo que conocemos como el Factor de dilución. Factores de dilución El factor de dilución puede ser definido como una proporción que indica el número de veces que hay que diluir el material original. Esta proporción nos indicará cuántas partes de la muestra original hay que colocar en el total de partes de la mezcla. Matemáticamente podemos calcular el factor de dilución utilizando volúmenes o concentraciones: Factor de dilución (FD) = Ci Cf = Vf Vi Si utilizamos la concentraciones del ejemplo anterior para calcular el Factor de Dilución tendríamos: FD = 5células ml 2células ml = 5 2 = 2.5 = 2.5 Esto quiere decir que para obtener una solución con 2 células/ml es necesario diluir la solución original 2.5 veces. Es importante notar que por ser una proporción los factores de dilución no tienen unidades y siempre se describen como una razón de partes totales a partes de soluto. Generalmente se expresarán como el recíproco: Unidad de Diluciones Dr. Ayala del Río 2

3 FD = 2.5 = Volumen de soluto Volumen total de la solución Por ser una proporción, es necesario que siempre expresemos los factores de dilución relativo a una unidad de soluto. Si al calcular el FD necesario el soluto tiene un valor menor de, entonces es necesario convertirlo a un valor entero. Si en el caso anterior el volumen de inóculo hubiese sido 0.5 ml entonces el factor de dilución hubiese sido: FD = Volumen de soluto Volumen total de la solución = El factor de dilución descrito no cumple con el criterio de que el volumen de soluto debe ser un valor entero. Es necesario convertirlo en un entero. Existen varias maneras de hacer dicha conversión matemática. Una manera rápida es buscar el número con el que se multiplicaría el volumen de soluto para convertirlo en. Esto se puede obtener dividiendo entre el volumen de soluto: Múltiplo = Volumen de soluto = 0.5 = 2 Si multiplicamos el factor de dilución anterior (numerador y denominador) por dos tendríamos: " 2 = 5 El factor de dilución de la nueva mezcla sería 5. Empleando el factor de dilución original de 2.5 podríamos decir que si queremos preparar una solución a una concentración de 2 células/ml, podemos combinar ml de la solución original (5 células/ml) en un total de 2.5 ml de solución. Esto no nos dice el volumen de solvente que necesitaríamos para preparar dicha dilución. Para obtener el volumen de solvente necesario, le restaríamos el volumen de solución original del volumen total: Volumen de solvente = Volumen total de la solución "Volumen de soluto En el ejemplo original el volumen de solvente sería.5 ml. Unidad de Diluciones Dr. Ayala del Río 3

4 Los factores de dilución son una herramienta poderosa en la preparación de soluciones. El conocer la proporción en que necesitamos diluir un soluto nos permite poder calcular distintos volúmenes de solución utilizando principios de proporcionalidad. Por ejemplo, si quisiéramos preparar un total de 35 ml de una dilución /2.5 podemos utilizar la siguiente relación proporcional: 2.5 = x 35 donde x representa el volumen de soluto necesario para mantener el mismo factor de dilución original. Debemos recordar que un factor de dilución representa la proporción de soluto a mezcla total. Por esta razón es que podemos despejar para un desconocido utilizando una igualdad. Si despejamos para x tendremos que el volumen de soluto necesario para obtener 35 ml de solución será 4 ml. Diluciones en serie Un cultivo de Escherichia coli puede alcanzar densidades de 3x0 9 células/ml en un periodo de 24 horas. Sin embargo, para poder enumerar densidades de bacterias utilizando métodos de enumeración viable, como el plato disperso, es necesario diluir el cultivo para que tengamos en el plato entre 30 y 300 unidades formadoras de colonia (ufc). Si asumimos que en un plato se coloca ml de la solución, podríamos calcular el factor de dilución necesario utilizando las concentraciones antes descritas: FD = 3x09 células/ml 300 células/ml = x07 Si fuéramos a preparar esta dilución en una botella necesitaríamos ml de cultivo y 9,999,999.0 ml de solvente (9, litros). Esto presenta varios problemas. En primera instancia no podríamos medir con suficiente exactitud un valor como 9, litros. En segundo lugar, esto representa un desperdicio de recursos para colocar ml de solución en un plato de cultivo. Es por esta razón que recurrimos a las diluciones en serie. Las diluciones en serie requieren que la muestra se diluya en múltiples pasos de manera sucesiva. Esto permitirá obtener factores de dilución altos, pero manteniendo los volúmenes totales bajos. Para obtener el factor de dilución acumulado en diluciones en serie, multiplicamos el factor de dilución de cada paso desde el principio hasta el final. Por ejemplo, si utilizamos diluciones en serie para poder obtener el factor de dilución de /x0 7 podríamos utilizar un esquema como el siguiente: Unidad de Diluciones Dr. Ayala del Río 4

5 El factor de dilución acumulado se obtendría de la multiplicación de los factores de dilución en cada paso: Factor de dilución acumulado = 00 * 00 * 00 * 0 = 0,000,000 * * 0,000,000 se puede expresar como x0 7 La mayor ventaja de las diluciones en serie es que reducimos dramáticamente el volumen de solvente necesario. En el ejemplo anterior utilizamos un total de 306 ml, una cantidad significativamente menor que los 9,999,999.0 ml requeridos si fuéramos a realizar la dilución en un solo paso. Otra ventaja de las diluciones en serie es que la disminución en el volumen de las diluciones tiene como efecto aumentar la exactitud de la medidas. Esto resultará en resultados mas exactos y reproducibles. Es importante recordar que aunque en el ejemplo anterior utilizamos mezclas de solvente de ml y 99 de solvente para lograr una dilución /00 lo mismo se puede lograr en volúmenes más pequeños de muestra y solvente utilizando principios de proporcionalidad. La siguiente tabla ilustra este principio FD Soluto (ml) Solvente (ml) Total (ml) / / / / Note que en los cuatro casos presentados en la tabla siempre se conserva el factor de dilución, pero los volúmenes de soluto y solvente varían. La pregunta que uno se debe hacer: qué volumen debo de emplear? Estadísticamente hablando, si empleamos volúmenes mayores la probabilidad de encontrar microorganismos en la muestra será mayor. Sin embargo, hay que considerar los errores de medida. Volúmenes entre 0. ml y 0 ml pueden ser medidos con alta precisión utilizando pipetas serológicas, Unidad de Diluciones Dr. Ayala del Río 5

6 mientras que volúmenes por debajo de 0. ml pueden medirse con mayor precisión utilizando micropipetas. La decisión de los volúmenes a utilizar dependerá de los materiales que tenga disponibles y los volúmenes de solución que necesite. Determinación de densidad y corrección por volumen de inóculo Una vez diluidas nuestras muestras, el próximo paso es inocular los medios de cultivo para determinar la densidad. El volumen de inóculo a ser empleado dependerá principalmente del método de enumeración empleado. Sin embargo, ese volumen tendrá un efecto en los cálculos de la densidad. Si tenemos un esquema de diluciones como el de la figura a continuación, cómo podemos calcular la densidad de bacterias en el cultivo? Para calcular la densidad de microorganismos en la muestra original seguiremos los siguientes pasos:. Calcular el factor de dilución acumulado de la dilución a enumerar (el plato que con 233 unidades formadoras de colonia [ufc]). El resultado sería: Factor de dilución acumulado = 00 * 00 * 00 * 0 = x0 7 Unidad de Diluciones Dr. Ayala del Río 6

7 2. Multiplicar el recíproco del factor de dilución acumulado por el número de colonias en el plato "0 7 * 233 = 2,330,000,000 En notación científica se expresaría : 2.33 " Las unidades dependerán del volumen de inóculo en el plato. En este caso se empleó.0 ml por lo tanto las unidades serán ufc/ml. Dependiendo del método de enumeración empleado es que decidiremos el volumen a inocular en el medio de cultivo. Aunque en el ejemplo anterior empleamos.0 ml de inóculo muchos métodos de enumeración solo emplean 0. ml. Si empleamos 0. ml de inóculo entonces: cómo serán las unidades? Unidades de ufc/0.ml no hacen sentido. Por esta razón es que cuando inoculamos volúmenes menores de.0 ml tenemos que hacer una corrección que equivale a un factor de dilución. Esta corrección se calcula dividiendo el volumen de inóculo sobre.0. Corrección = Volumen de inóculo.0 = 0..0 = 0 La corrección calculada es un factor de dilución adicional que hay que añadir al cálculo de densidad. Esto quiere decir que si en el ejercicio pasado hubiésemos usado 0. ml de volumen de inóculo, entonces el cálculo de densidad sería: Densidad del cultivo = "07 " 233 " 0 = 2.33 " 00 ufc/ml Esta corrección implicó un aumento por un factor de 0 en la densidad de la muestra original. Ejercicios de práctica. La compañía de Biotecnología Puertorriqueña está lista para producir una proteína recombinante usando un clon bacteriano. Para esto hay que preparar un inóculo inicial que será llevado a un fermentador. El procedimiento para preparar el inóculo indica que se combinen 8.0x0 5 células liofilizadas (i.e. en polvo) en 20 ml de medio de cultivo. a. Cuál será la densidad del inóculo inicial? b. Si en lugar de 20 ml de medio se añaden 35 ml de medio, cuál será la concentración? Unidad de Diluciones Dr. Ayala del Río 7

8 2. Para detectar bacterias fijadoras de nitrógeno estaremos empleando un anticuerpo específico para la nitrogenasa. Como el anticuerpo es extremadamente sensitivo, una dilución de :5,000 es suficiente para detectar la enzima. Sin embargo, para realizar el experimento solo necesitamos 8 ml de anticuerpo diluido. Calcule el volumen de solvente y anticuerpo para producir 8 ml de anticuerpo. 3. El técnico de laboratorio le entregó una suspensión de Escherichia coli a una densidad de 2.4x0 7 células/ml. El experimento que realizarás necesita que E. Coli esté a una densidad de.0x0 3 células/ml. a. Calcula el factor de dilución para lograr esto. b. Calcula los volúmenes de salina y células para preparar 00 ml de dilución. c. Calcula cuántas células hay en los 00 ml de dilución. 4. Si preparamos cuatro diluciones en serie con los siguientes volúmenes: a. Calcule el factor de dilución en cada dilución b. Calcule el factor de dilución acumulado # de dilución Volumen Soluto Volumen Solvente Su compañero de laboratorio y usted son responsables de enumerar la densidad de un cultivo de Staphilococcus aureus. Su compañero no durmió mucho anoche y en la primera dilución mezcló 0.7 ml del cultivo con 25 ml de diluente. De esa dilución tomó 0.25 ml y los combinó con 9.75 ml de diluente. Finalmente usted inoculó el plato con 0.3 ml de la ultima dilución. El resultado de la enumeración fueron 60 ufc. a. Calcule el factor de dilución acumulado incluyendo la corrección de inóculo. b. Calcule la densidad del cultivo original. 6. El volumen del cultivo original eran 0 ml. Luego de realizar diluciones en serie para un factor de dilución total / se obtuvieron 43 colonias por plato. Cuantas células en total habían en el cultivo original? Asuma que el volumen de dilución inoculado en cada plato fue de 0. ml. 7. Un técnico nos informa que la densidad del cultivo con el que trabajará es 3.5x0 6 células/ml. Para obtener este número él contó 45 colonias en un plato que fue inoculado con 0. ml. Conteste las siguientes preguntas: a. Calcule el factor de dilución TOTAL para obtener el resultado propuesto. b. Recree el esquema de diluciones empleado por el técnico para lograr ese resultado. Recuerde que el volumen máximo que el técnico puede emplear en una dilución es 00 ml. 8. Usted tiene un cultivo con una concentración desconocida para el cual obtiene 257 colonias en una dilución /x0 8. Calcule la densidad original del cultivo. Unidad de Diluciones Dr. Ayala del Río 8

9 9. Un estudiante empleó el siguiente esquema de diluciones: diluir 0. ml del cultivo original en 9.9 de diluente. De esa dilución transfieres 0. ml a 9.9 de diluente. Finalmente transfieres 0.2 ml de la ultima dilución al plato. El promedio de ufc fue 232. a. Haga un dibujo del esquema de diluciones b. Calcule el factor de dilución de cada paso (incluyendo corrección de ser necesaria) y total. c. Calcule la densidad del cultivo original. 0. Dado que un cultivo debe tener una densidad aproximada de 5x0 células/ml diseñe un esquema de diluciones donde pueda emplear las botellas de dilución con 90 ml de salina que tengo disponibles y que le produzca entre 30 y 300 ufc en el plato. Unidad de Diluciones Dr. Ayala del Río 9

10 Soluciones problemas de práctica. a. b. 8.0 "0 5 células 20 ml 8.0 "0 5 células 35 ml = 4.0 " 0 4 células/ml = 2.29 " 0 4 células/ml 2. La manera más sencilla de resolver este ejercicio es emplear proporciones: 5,000 = X 8 8 5,000 = X 5.33 " 0-4 = X 3. a. El factor de dilución sería: Ci Cf = 2.4 "07 células/ml.0 "0 3 células/ml = 24,000 b. Para calcular los volúmenes de salina e inóculo puedes emplear una proporción: 24,000 = x ,000 = x = x c. Número total de células células.0 "0 3 "00 ml = 00,000 células ml Unidad de Diluciones Dr. Ayala del Río 0

11 4. Contestaciones en la tabla # de dilución Volumen Soluto Volumen Solvente (a) Factor de dilución (b)factor de dilución acumulado /00 / /0 /, /56 /56, /6 /896, Factor de dilución a. Primera dilución = 0.7/25.7 = /36.7 Segunda dilución = 0.25/0 = /40 Factor de corrección =.0/0.3= /3.33 Factor de dilución acumulado 36.7 " 40 " 3.33 = 4,888 b. Densidad del cultivo sería: 60 ufc " 4,888 = 7.82 " 0 5 ufc/ml 6. En este ejercicio tienes que asumir que el volumen de inóculo es.0 ml. Entonces el número de células será: 0,000,000 " 43 colonias = 4.3"0 8 células/ml 7. Células totales = 4.3"0 8 células ml "0 ml = 4.3 " 0 9 células a. Este ejercicio se puede resolver empleando un poco de álgebra 45 " X = 3.5 "0 6 células/ml X = 3.5 "06 células/ml 45 X = 70,000 El factor de dilución total seria /70,000 Unidad de Diluciones Dr. Ayala del Río

12 b. Para recrear el esquema, primero debemos separar el factor de dilución de las botellas y la coerción. En este caso, la corrección sería /0. =/0. Para conocer el factor de dilución de las botellas podemos dividir el factor de dilución total entre la corrección. 8. La densidad original del cultivo sería 257 " "08 = 2.57 " 0 0 células/ml 9. Ver figura para las contestaciones a, b y c 0. Este problema requiere que inicialmente calculemos un factor de dilución para luego trabajar el esquema. El factor se puede calcular empleando la cantidad de células en un mililitro de cultivo original y el número de ufc que deseamos tener Unidad de Diluciones Dr. Ayala del Río 2

13 en el plato (entre 30 y 300). Vamos a asumir que deseamos tener 200 colonias en el plato. FD = 5 "0 200 = 2,500,000, "09 = Ahora necesitamos que el factor de dilución total de nuestro esquema de diluciones sea igual al que acabamos de calcular. Como se nos proveen botellas de 90 ml de salina lo más sencillo es emplear diluciones de /0 en las botellas. Para solucionar el ejercicio podríamos emplear ocho botellas de /0 y luego que la dilución en el plato sea /25 o emplear 9 botellas de /0 y que la dilución al llevar al plato sea /2.5. Para confirmar que nuestro esquema está correcto podemos emplear el factor de dilución obtenido y la densidad original para calcular cuántos ufc deben haber en la placa. Densidad FD = 5 "0 2.5 "0 9 = 5 "0 2.5 "0 9 = 200 Unidad de Diluciones Dr. Ayala del Río 3

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